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石蜡切片与HE染色

                                           发布于:2018-4-9


石蜡切片

1

什么是石蜡切片

2

石蜡切片的制备

3

常见问题以及解决方案

石蜡切片

石蜡切片组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法,光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别出;而组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤来达到长期保存标本的目的,而能清晰辨认其形态结构。石蜡切片主要包括以下几个方面:

取材

取材要快,组织块不宜太大,通常5mmx5mmx2mm为宜

固定

固定液要新鲜配置,最少固定24h,用量一般为组织块体积的20-30倍

脱水

脱水要彻底,低、高浓度酒精中停留时间不能太长,时间太长会使组织变软变脆

透明

透明要迅速,在密闭容器中进行

浸蜡

浸蜡温度要恒定,低温,操作迅速以防止组织变硬,变脆,收缩

包埋

包埋蜡与浸蜡所用蜡不能使用同一种,要区别开来

切片

切片厚度一般在4-10微米


一张好的切片应该薄厚均匀,舒展无裂痕、无脆烂,如何切出一张完美的切片,每一步都很重要,任何一步出现问题 ,都会影响切片的质量,而最易出现问题,最难解决的一个环节就是切片这一环节,下面就对于切片过程中易出现的问题以及解决办法做一些说明:


切片常见问题以及解决方案

1

切片上卷

原因: 1、石蜡硬度大 2、切片厚 3、切片速度过快 4、切片刀孤度大, 作用于蜡条剪切力大 5、切片刀变钝

应对方法: 1、更换熔点低的石蜡  2、减小切片厚度 3、减慢切片速度 4、减小切片刀孤度 5、更换新的切片刀或更换切片刀位置


2

切片横向褶皱多

原因: 1、蜡块温度过高 2、切片刀变钝 3、切片刀边缘粘有少量石蜡致刀片不锋利 4、切片刀斜度大折碎蜡条 5、石蜡过硬 6、蜡条有少许褶皱,但是影响贴片与观察

应对方法: 1、将蜡块重新放置冰袋或冷冻盒上,使蜡块降温 2、更换切片刀的位置,或更换新的切片刀 3、用湿纱布顺切片刀刀口方向, 轻轻擦拭切片刀 4、减小切片刀孤度 5、更换熔点较低的石蜡 6、切片时可用嘴轻轻吹平蜡条

3

切片上有同等位置的裂缝或划纹

原因:1、切片刀有小缺口 2、蜡块内有杂质或体积较小的似钙化性较硬的组织 3、包埋时蜡块凝固不均匀或包埋不充分,混有小气泡,或蜡中混有杂质

应对方法: 1、移动切片刀或更换新的切片刀 2、用少量盐酸酸化硬的钙化性组织3、重新包埋蜡块


4

切出的蜡条不成带状

原因: 1、弯曲处蜡块质地不均,蜡块未修整好,偏向一侧,蜡块边缘毛糙 2、弯曲处切片刀变钝 3、上侧或下侧蜡块修整不平行 4、空气干燥,容易有静电产生,蜡条易互相吸附卷曲

应对方法: 1、重新修整蜡块 2、移动切片刀或更换新的切片刀 3、修整蜡块上下缘,使两处皆与刀口平行; 或冷冻蜡块 4、用纱布蘸水,轻轻湿润蜡块

5

切片卷曲不易伸展,有裂痕

原因: 1、蜡块温度高 2、切片刀变钝

应对方法: 1、将蜡块重新放置冰袋或冷冻台上,使蜡块降温 2、更换切片刀的位置,或更换新的切片刀 


6

切片厚薄不匀

原因: 1、蜡块过硬或过大 2、蜡块夹持器或切片刀松动 3、切片机微动失灵,不能调节出正确的切片厚度

应对方法: 1、组织块过硬可重新取材包埋,过大可重新包埋,较硬的组织,取材时每个蜡块包埋组织不宜过大,可将组织切开后分别脱水包埋 2、上紧刀片 3、请专门维修人员修理机器


HE染色



HE染色定义▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼▼

HE染色又称为苏木精-伊红染色,染色后的组织或细胞可以借助普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死。此方法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色,细胞核被苏木素染成蓝紫色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

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操作步骤

大致染色过程如下:

 


HE染色常见问题


1、染色

A染色太浅,细胞核与细胞质对比度差

原因染色时间短或者苏木素过度氧化,失去染色能力,分化时间过长

对策切片重新染

B染色太深,细胞核与细胞质颜色比例失调

原因切片太厚、分化时间太短、染色时间过长

对策切片厚的话重新切片;若果不是这个原因,脱色、漂洗、重新染色,对于染色以及分化时间做适当调整


2、脱蜡

A、脱蜡不彻底,不能使切片着色

原因烤片温度太低,脱蜡前没有充分烤干或二甲苯脱蜡时间太短或二甲苯使用时间过久

对策用无水乙醇去掉玻璃片上的水分,重新二甲苯脱蜡,延长脱蜡时间,及时更换二甲苯。


3、伊红染色

A、伊红染色不均匀

原因切片太薄;伊红PH可能大于5;切片在伊红染色后在乙醇停留时间太长;蓝化液残留太多

对策检查伊红PH,调整其PH4.6-5.0之间;每次返蓝之后冲净;脱水时不要让切片在低浓度乙醇中停留时间太长,含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉

B、伊红深染

原因伊红浓度太高;染色时间太长;乙醇脱水时间太短;

对策适当稀释伊红染液;减少染色时间;脱水时间相对均匀



HE染色评价

 

一张好的HE染色切片染色后细胞质呈粉红色,细胞核呈蓝紫色,结缔组织呈粉红色,肌肉呈深红色,血管呈粉红色,细胞着色清晰,颜色艳丽,细胞形态清晰,界线清楚。



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HE染色结果

                       

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