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circRNA知多少?

                                           发布于:2018-7-31

1. 什么是环状RNA

根据RNA编码蛋白与否,RNA可以大致分为两大类,编码蛋白的一类为mRNA,另一类为非编码RNA(Non coding RNA,ncRNA)。非编码RNA又可以进一步分为核糖体RNA(rRNA)及长非编码RNA和短非编码RNA。短非编码RNA包括miRNA,piRNA,siRNA及tRNA,snoRNA。长非编码RNA包括lincRNA,asRNA,假基因,circRNA。

Chan et al., International Journal of Molecular Sciences, 2018


其中circRNAs(circular RNAs,环状RNA分子)是一类经反向剪切后,不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。广泛存在于多种生物细胞中,具有结构稳定,序列保守及细胞或组织特异性表达等特征。环状RNA根据其来源又可以分为ElciRNA(外显子-内含子 circRNA),ecircRNA(外显子 circRNA),ciRNA(内含子 circRNA)及tricRNA(tRNA来源)。



Lei et al., Experimental Cell Research, 2018


2.环状RNA的特点

1) 大部分是非编码RNA(non-coding RNAncRNA),没有PolyA结构;

2) 大多数由外显子形成,少数来源于内含子或内含子片段;

3) 大多数定位于细胞质中,少数定位于细胞核内,具有一定的组织、时序和疾病特异性;

4) 不易被核酸外切酶 RNase R降解,与线性RNA相比能更稳定地存在于人体内;

5) 在人体细胞中广泛表达,它们的表达水平有时甚至超过了它们线性异构体的10倍之多;

6) 多数具有高度保守序列,仅少数在进化上不保守;

7) 同一个基因序列即可转录成线性RNA,又可以转录成环状RNA;

8) 有些circRNA 具有微小RNA ( microRNAmiRNA) 应答元件 ( microRNA response elementMRE),能与 miRNA 相互作用,从而调控靶基因的表达;

9) 大多数 circRNA 能在转录或转录后水平发挥调控作用,少数只能在转录水平发挥作用。


3.环状RNA功能

1) 通过顺式或反式的方式调控线性RNA的转录或选择性剪切

2) 吸附miRNA,通过 MRE(microRNA response element, MRE) 竞争性结合 miRNA 调节基因的表达。

3) 与蛋白相互作用来影响细胞行为

4) 作为模板翻译成蛋白或多肽


Han et al., Pharmacology & Therapeutics, 2018


4.环状RNA的验证

1)circRNA定量验证 

circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同,常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物,称之为convergent primer,需扩增的片段位于上下游引物之间(如下图)。而对于circRNA,尤其外显子环化circRNA,除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外,body区与linearRNA是一致的。因此,验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer,称之为divergent primer(如下图),而且设计的PCR product的长度越短越好,可以增强backsplice junction位点处扩增效率。



为增强circRNA的验证效率,起始模版需满足以下要求(3 free):

A. DNA free;

B. rRNA free;

C. linear RNA free。

验证策略:对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增,电泳检测PCR product大小(如下图)。



2)circRNA Northern blot验证

Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法,需围绕circRNA设计探针序列,而探针序列设计是验证成功至关重要的环节。对于circRNA探针设计,我们建议以下两点:1. 对于外显子环化circRNA,建议探针尽可能跨backsplice junction位点;2.对内含子环化circRNA,可围绕内含子区域设计探针。

验证策略:对3 free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。


5.过表达及敲降

1) 环状RNA的过表达

circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制,已有多篇文章报道circRNA成环机制,目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对,称之为Alu结构。

基于circRNA侧翼Alu序列特征,PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列,随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切,进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本,定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。


过表达策略:

A. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列,侧翼上下游1kb处过表达效率更佳;

B. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。


2)环状RNA的敲降

circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA,对于内含子环化circRNA,也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。Divergent primer验证circRNA敲除倍数。


敲除策略:

A. 外显子环化circRNA,针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA,如下图所示;

B. 内含子环化circRNA,除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外,也可针对内含子区域序列设计siRNA。

C. 每个siRNA设计对应的对照,backsplice junction位点一端互补配对,另一端错配,如下图所示。


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