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噬菌体展示

                                           发布于:2018-8-13

一、概念

      噬菌体展示技术是一种将外源肽或蛋白的DNA序列与噬菌体外壳蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术。该技术实现了表型与基因型的统一。随着噬菌体展示技术的进一步发展,该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显,也使该技术得以不断的完善和发展。


二、噬菌体展示原理及过程

      噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。

Fig 1. 噬菌体展示原理

      被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性,以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的"吸附-洗脱-扩增"后,与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。筛选得到的高度亲和力的噬菌体集合中可能含有多个克隆,可以利用ELISA、Westen Blot 或DNA测序进一步对得到的外源蛋白进行筛选,或对蛋白进行铺盘分离单克隆菌株,从而得到特异性的单克隆抗体,进而进行dafabet中文版方面研究。

Fig 2. 噬菌体展示筛选过程


三、常用噬菌体展示系统分类

 展示系统主要分为:

单链丝状噬菌体(M13)展示系统、λ噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统、T4噬菌体

 ⑵所展示内容包括:

随机肽段、天然肽段、cDNA、抗体、抗体片段等等

 筛选方式包括:体外筛选和体内筛选

 

()单链丝状噬菌体(M13)展示系统

     丝状噬菌体是一种能够感染阴性细菌的dafa888黄金版大家族。他们都含有单链DNA基因组,其衣壳蛋白为管状,通常由几千个拷贝的主要衣壳蛋白(PⅧ)和位于尾端的次要衣壳蛋白(PⅢ)组成:

P展示系统:PⅢ是丝状噬菌体的次要外壳蛋白,位于dafa888黄金版颗粒的尾端,是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个dafa888黄金版颗粒都有3个~5个拷贝PⅢ蛋白,其在结构上可分为N1、N2和CT3个功能区域,这3 个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中N1 作用于E.coli细胞膜上的Tol A蛋白,与噬菌体入侵有关;N2为受体结合区,负责结合F菌毛;CT疏水区在组装前粘附在细菌内膜上,与噬菌体组装中止有关。PⅢ有2个位点可供外源序列插入,当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时,该系统保留了完整的PⅢ蛋白,噬菌体仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT 结构域相连,则噬菌体丧失感染性,这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解,所以有辅助噬菌体超感染时,可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白,即所谓“单价”噬菌体。

 

Fig 3. M13噬菌体结构

P展示系统:PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白,位于噬菌体外侧,C端与DNA结合,N 端伸出噬菌体外,每个dafa888黄金版颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附近可融合五肽,但不能融合更长的肽链,因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配,使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时,可提供野生型PⅧ蛋白,降低价数,此时可融合多肽甚至抗体片段。

目前最常用的M13筛选系统为NEB提供的3种随机肽库和供自制肽库所需的M13KE克隆展示载体。这3种肽库包括7肽库(Ph.D.-7),12肽库(Ph.D.-12)和受约束于二硫键的环7肽库(Ph.D.-C7C)。

优点:

(1)有MCS,便于克隆不同的酶切片段。

(2) Xgal显色反应,可供直接选择。

(3)无包装限制,克隆能力大。

(4)可以克隆双链DNA分子中的每一条链(子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA)。

缺点:

① 插入外源DNA后,遗传稳定性显著下降。

② 实际克隆能力小于1500bp(虽无包装限制,并非无限包装)。

 

() λ噬菌体展示系统

      λ噬菌体由头和尾构成,其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子,组装在头部蛋白质外壳内部,其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时,通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌,而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链,可以两种不同的方式繁殖(图20-3):①溶菌性方式(lytic pathway):在营养充足,条件适合细菌繁殖时,利用宿主菌中的酶类和原料,λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质,λ DNA经多次复制合成许多子代λ DNA,于是装配成许多子代的λ噬菌体,最后裂菌,释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式(lysogenic pathway):进入细菌的λDNA可整合(integrate)入细菌的染色质DNA中,随细菌染色体DNA复制,传给细菌后代,这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λ DNA称为原噬菌体(prophage),含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。λ DNA的整合是可逆的,原噬菌体可从宿主DNA中切出,进入溶菌性方式的繁殖。λ噬菌体展示系统又可以分为以下两类:

PV展示系统:λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分,该管状结构由32个盘状结构组成,每个盘又由6个PV 亚基组成。PV有两个折叠区域,C端的折叠结构域(非功能区)可供外源序列插入或替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行,故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体,这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。

Fig 4. λ噬菌体结构

D蛋白展示系统:D蛋白的分子质量为11 ku,参与野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明,D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,故D蛋白可作为外源序列融合的载体,而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。dafa888黄金版颗粒的组装可以在体内也可以在体外,体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面,而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中,从而补偿溶源菌所缺的D蛋白,通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特点,噬菌体上融合蛋白和D 蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA 活性加以控制,这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。

() T4 噬菌体展示系统

      T4噬菌体是噬菌体的一个品系,属于T-系噬菌体,为烈性噬菌体。具有典型的蝌蚪状外形:六角形的头部和可收缩的长的尾部。头部的蛋白质外壳内含有折叠的DNA分子;尾部的蛋白质外壳为一中空的长管,外面包有可收缩的尾鞘。头部大小为65*95纳米(nm),颈部长95nm,尾部120纳米。侵染寄主时,尾鞘收缩,头部的DNA即通过中空的尾部注入细胞内。T-系噬菌体是研究最广泛和深入的细菌噬菌体,侵染大肠杆菌(一种正常栖居在人类肠道中的细菌)B菌株,T为英文Type的字头,并按其发现的前后顺序编号为T1,2,3,4,5,6,7,因其偶数型(2,4,6)结构的化学组成与奇数型(1,3,5,7)不同,故又分为T-偶数系与T-奇数系。例:T4属偶数系。

            

Fig 5. T4噬菌体结构

       T4 噬菌体展示系统的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质,分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC(9 ku)和HOC(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面,因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化,避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4 噬菌体是在宿主细胞内装配,不需通过分泌途径,因而可展示各种大小的多肽或蛋白质,很少受到限制。同时,SOC与HOC蛋白的存在与否,并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面,事实上,在DNA包装被抑制时,T4是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体(SOC和HOC也同时组装)。因此,在用重组T4做疫苗时,它能在空衣壳表面展示目的抗原,这种缺乏DNA的空衣壳苗,在生物安全性方面具有十分光明的前景。

 

() T7 噬菌体展示系统

      T7 噬菌体是20 世纪90 年代末期建立的一种新型噬菌体展示技术。T7 噬菌体是一种含有双链丝状DNA的烈性噬菌体,其衣壳蛋白一般又10A和10B两种形式,属于T-系噬菌体:奇数系。外源基因插入的位置一般位于10B蛋白的C端,这样好处有两点,一方面C 端结合空间位阻小;另外一方面,C端的蛋白较晚被翻译,即使是外源蛋白质的编码基因中含有终止密码子,也不影响与其N端融合的10B蛋白的完整表达。与M13系统相比,T7噬菌体直接使宿主菌进行裂解,因而不需经过分泌过程。因此,对于那些对分泌过程有抑制作用的蛋白和多肽,在M13系统不能很好的展示,但是可以在T7系统中展示。除此之外,T7噬菌体优势有: 生产非常迅速,在固体培养基上形成噬菌体只需3h,在菌液中从感染到裂解只需1~2h,可以节省大量的时间;对于>50个氨基酸的多肽,T7噬菌体可以在不需要辅助噬菌体的情况下进行包装。  可高拷贝数展示约50个氨基酸的多肽片段(450/噬菌体),可中拷贝数展示900~1200个多肽片段(5~15/噬菌体),可低拷贝数展示900~1200个氨基酸的多肽片段(0.1~1/噬菌体)。 T7噬菌体在高PH值、高盐、变性剂(100 mmol/L DTT)等条件下十分稳定,可根据不同需要采用多种条件进行筛选,并能在筛选后仍然保持很高的筛选活性。

Fig 6. T7噬菌体结构


四、噬菌体展示应用

      噬菌体展示技术拥有诸多优势,它实现了蛋白/多肽基因型与表型的统一,在蛋白质与其遗传基因之间建立了直接的物理联系;可以快速的筛选得到所需抗体;通过这项技术不仅可以筛选到一般抗原的特异性抗体,也可以产生非免疫原性或毒性抗原的抗体,能够产生具有识别功能的人抗体,如scFv、Fab、双功能抗体,及三价四价抗体等。所得到的抗体可以是Fab、scFv,也可以进行抗体工程改造,转变成其他形式的小分子抗体、免疫毒素、靶向细胞因子或全抗体等,应用广泛;相较于免疫动物生产单克隆抗体,利用噬菌体展示技术生产单克隆抗体,生产快速,操作简便,效率更高,且可以进行人源化抗体的生产,具有更高的利用价值。经过多年的研究与发展,噬菌体展示技术已成为一门综合了多个学科理论、方法及策略的前沿技术,在免疫学、分子dafabet中文版、基因功能组学和新药研究等领域发挥着不可替代的作用。

参考文献:

 

[1] Ledsgaard LKilstrup MKaratt-Vellatt AMcCafferty JLaustsen AH. Basics of Antibody Phage Display Technology. Toxins (Basel). (2018) 9:10(6).

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